PCR, RTPCR এবং qPCR কৌশলগুলির নির্দেশিকা

আপনি কি কখনও পরীক্ষাগারে "পিসিআর", "আরটি-পিসিআর" এবং "কিউপিসিআর" শব্দের দ্বারা বিভ্রান্ত হয়েছেন? চিন্তা করবেন না, এই নিবন্ধটি সহজ ভাষায় এই কৌশলগুলির মধ্যে পার্থক্য স্পষ্টভাবে ব্যাখ্যা করবে,আপনাকে আপনার গবেষণায় আরও কার্যকরভাবে নেভিগেট করতে সহায়তা করে.

পিসিআর, বা পলিমারেজ চেইন রেঅ্যাকশন, ডিএনএ "ফটোকপি মেশিন" এর মত কাজ করে। এই মৌলিক আণবিক জীববিজ্ঞানের কৌশল, কারি মলিস দ্বারা উদ্ভাবিত, দ্রুত লক্ষ্য ডিএনএ ক্রমগুলিকে ইন ভিট্রোতে প্রসারিত করে,কয়েক ঘন্টার মধ্যে লক্ষ লক্ষ থেকে বিলিয়ন কপি তৈরি করা. পিসিআর জিন ক্লোনিং, ডিএনএ সিকোয়েন্সিং, রোগ নির্ণয় এবং অন্যান্য অনেক অ্যাপ্লিকেশনের জন্য অপরিহার্য।

পিসিআর প্রক্রিয়াটি তিনটি পুনরাবৃত্তি ধাপ নিয়ে গঠিত যা এক্সপোনেন্সিয়াল ডিএনএ পরিবর্ধনের অনুমতি দেয়ঃ

1. ডেনাচারেশনঃউচ্চ তাপমাত্রা (94-98°C) ডাবল-স্ট্র্যান্ডড ডিএনএকে একক স্ট্র্যান্ডে পৃথক করে।
2. অ্যানিলিং:তাপমাত্রা হ্রাস (50-65 °C) প্রাইমারকে পরিপূরক লক্ষ্য ক্রমগুলিতে আবদ্ধ করতে দেয়।
3. সম্প্রসারণঃডিএনএ পলিমারেজ (সাধারণত টাক পলিমারেজ) ৭২ ডিগ্রি সেলসিয়াসে নতুন পরিপূরক স্ট্র্যান্ড সিনথেসিস করে।

২৫-৪০ টি চক্রের পর, অ্যাগারোজ জেল ইলেক্ট্রোফোরেস ব্যবহার করে বর্ধিত ডিএনএ দৃশ্যমান করা যায়।

কোন্টিটিভেটিভ পিসিআর (কিউপিসিআর) বা রিয়েল-টাইম পিসিআর প্রচলিত পিসিআরের উপর ভিত্তি করে রিয়েল-টাইমে পরিবর্ধন পর্যবেক্ষণের জন্য ফ্লুরোসেন্স সনাক্তকরণকে অন্তর্ভুক্ত করে প্রাথমিক ডিএনএ টেমপ্লেট পরিমাণের পরিমাণ নির্ধারণ করে।

দুটি প্রাথমিক ফ্লুরোসেন্স সনাক্তকরণ পদ্ধতি বিদ্যমানঃ

• ডিএনএ-বন্ধনকারী রঙ্গক (যেমন, SYBR সবুজ):ব্যয়বহুল কিন্তু অ-নির্দিষ্ট, সমস্ত ডাবল-স্ট্র্যান্ড ডিএনএকে আবদ্ধ করে।
• ফ্লুরোসেন্ট প্রোব:লক্ষ্য-নির্দিষ্ট কিন্তু আরো ব্যয়বহুল, কাস্টম-ডিজাইন জোনের প্রয়োজন।

মূল qPCR মেট্রিক হল Ct (থ্রেশহোল্ড চক্র) মান, যখন ফ্লুওরেসেন্স একটি সংজ্ঞায়িত থ্রেশহোল্ড অতিক্রম করে তখন চক্রের সংখ্যা। কম Ct মানগুলি উচ্চতর প্রাথমিক টেমপ্লেট ঘনত্ব নির্দেশ করে।

অ্যাপ্লিকেশনগুলির মধ্যে রয়েছেঃ

• জিন এক্সপ্রেশন বিশ্লেষণ
• প্যাথোজেন সনাক্তকরণ
• মাদক পরীক্ষা
• ক্যান্সার গবেষণা

বিপরীত ট্রান্সক্রিপশন পিসিআর (আরটি-পিসিআর) প্রথমে বিপরীত ট্রান্সক্রিপটেজ ব্যবহার করে আরএনএকে পরিপূরক ডিএনএতে (সিডিএনএ) রূপান্তর করে, তারপরে স্ট্যান্ডার্ড পিসিআরের মাধ্যমে সিডিএনএকে প্রসারিত করে। এটি আরএনএ বিশ্লেষণকে সক্ষম করে, যার মধ্যে রয়েছেঃ

• জিন এক্সপ্রেশন স্টাডিজ
• আরএনএ ভাইরাস সনাক্তকরণ (যেমন, এইচআইভি, ইনফ্লুয়েঞ্জা)
• আরএনএ কাঠামো / ফাংশন গবেষণা

রিয়েল-টাইম কুইন্টিটেটিভ আরটি-পিসিআর আরএনএ এক্সপ্রেশন স্তরের পরিমাণ নির্ধারণের জন্য কিউপিসিআর এর সাথে বিপরীত প্রতিলিপিকে একত্রিত করে। এই সোনার মানক পদ্ধতিটি ব্যাপকভাবে ব্যবহৃত হয়ঃ

• সঠিক জিন এক্সপ্রেশন পরিমাপ
• মাইক্রোআরএনএ কোয়ান্টিফিকেশন
• দীর্ঘ অ-কোডিং আরএনএ গবেষণা

qPCR এর জন্য বিশেষত্ব নিশ্চিত করার জন্য সাবধানে ডিজাইন করা প্রাইমার এবং প্রোবগুলির প্রয়োজন। অসঙ্গতি মিথ্যা ফলাফলের দিকে পরিচালিত করতে পারে।

বিভিন্ন এনজাইম (যেমন, এএমভি, এম-এমএলভি) তাপীয় স্থিতিশীলতা এবং দক্ষতায় পরিবর্তিত হয়, সিডিএনএ ফলনকে প্রভাবিত করে।

অপ্টিমাইজড অ্যানিলিং তাপমাত্রা এবং উচ্চ-বিশ্বস্ততা পলিমারেজগুলির মাধ্যমে অ-নির্দিষ্ট পরিবর্ধনকে হ্রাস করা যেতে পারে।

এই আণবিক কৌশলগুলির পার্থক্য বোঝা গবেষকদের তাদের নির্দিষ্ট পরীক্ষামূলক প্রয়োজনের জন্য উপযুক্ত পদ্ধতি নির্বাচন করতে সক্ষম করে, সঠিক এবং নির্ভরযোগ্য ফলাফল নিশ্চিত করে।