ব্লগ সম্বন্ধে নিউক্লিক অ্যাসিড নিষ্কাশন কিটের মূল নীতি এবং সমস্যা সমাধান

নিউক্লিক এসিড এক্সট্রাকশন আণবিক জীববিজ্ঞানের পরীক্ষার মূল ভিত্তি হিসেবে কাজ করে। তবুও যখন বাণিজ্যিক এক্সট্রাকশন কিটের বিশাল পরিসরের সাথে মুখোমুখি হই,অনেক গবেষক নিজেদেরকে বিভ্রান্ত মনে করেন, বিশেষ করে অপ্রত্যাশিত ফলাফলের সমস্যা সমাধানের ক্ষেত্রে। This article demystifies the scientific principles underlying nucleic acid extraction kits while providing practical troubleshooting guidance to transform this essential technique from a "black box" operation into a predictable, কার্যকর প্রক্রিয়া।

বেশিরভাগ বাণিজ্যিক নিউক্লিক অ্যাসিড এক্সট্রাকশন কিটগুলি পাঁচটি সমালোচনামূলক পর্যায়ে সিলিকা ঝিল্লি স্পিন কলাম প্রযুক্তি ব্যবহার করেঃ কোষ লাইসিস, নিউক্লিক অ্যাসিড বন্ডিং, ওয়াশিং এবং বিশুদ্ধকরণ, শুকানো,এবং চূড়ান্ত এলুশনপ্রতিটি ধাপ পূর্ববর্তী ধাপের উপর ভিত্তি করে তৈরি হয়, যার মানে যে কোন ভুল ধাপ সমগ্র নিষ্কাশনকে বিপন্ন করতে পারে।

কার্যকর কোষ লাইসিস গুরুত্বপূর্ণ প্রথম ধাপ প্রতিনিধিত্ব করে। লাইসিস বাফার ফর্মুলেশন ডিএনএ বা আরএনএ নিষ্কাশন করা হচ্ছে কিনা তার উপর নির্ভর করে পরিবর্তিত হয়,কিন্তু সাধারণত উচ্চ ঘনত্বের chaotropic লবণ আছে যা দ্বৈত উদ্দেশ্য পরিবেশন করে:

• প্রোটিন ডেনাচারেশনঃএই লবণগুলি হাইড্রোজেন বন্ড, ভ্যান ডের ওয়াল্স বাহিনী এবং হাইড্রোফোবিক মিথস্ক্রিয়াকে ব্যাহত করে, নিউক্লিক অ্যাসিড বিঘটন রোধ করতে প্রোটিনগুলিকে অস্থির করে তোলে (নিউক্লিয়েজগুলি সহ) ।
• সিলিকা বন্ডিং সহজ করার জন্যঃচোট্রোপস নিউক্লিক অ্যাসিড থেকে জলের অণু স্থানান্তর করে, সিলিকা ঝিল্লিতে স্থানান্তরের জন্য সর্বোত্তম শর্ত তৈরি করে।

সাধারণ ক্যাওট্রপিক লবণের মধ্যে রয়েছে গুয়ানাইডিন হাইড্রোক্লোরাইড, গুয়ানাইডিন থিওসাইনেট, ইউরিয়া এবং লিথিয়াম পারক্লোরেট। প্রোটিন দ্রবণীয়তা এবং কোষ লাইসিসকে সহায়তা করার জন্য প্রায়শই ডিটারজেন্ট যুক্ত করা হয়।নমুনার ধরন অনুযায়ী, এনজাইমগুলিও অন্তর্ভুক্ত করা যেতে পারে। প্রোটিনাজ কে কার্যকরভাবে নিউক্লিক অ্যাসিড প্রস্তুতির মধ্যে প্রোটিনগুলি হজম করে, বিশেষত denaturing অবস্থার অধীনে। Lysozyme আরেকটি সাধারণ এনজাইম,যদিও এর কার্যকারিতা নিষ্কাশন অবস্থার অধীনে হ্রাস পায়.

প্লাস্মিড এক্সট্রাকশন আরএনএ বা জিনোমিক ডিএনএ বিচ্ছিন্নতা থেকে উল্লেখযোগ্যভাবে আলাদা। সমালোচনামূলক পার্থক্যটি প্রথমে জিনোমিক ডিএনএ থেকে প্লাস্মিড ডিএনএ পৃথক করার মধ্যে রয়েছে।অবিলম্বে chaotropic লবণ যোগ করা সব ডিএনএ ধরনের নির্বিচারে মুক্তি হবেঅতএব, প্লাস্মিড প্রোটোকলগুলি সাধারণত প্রাথমিক কোষ লাইসিসের পরে ক্যাওট্রোপগুলি প্রবর্তন করে।

লিসিসের বাইরে, চোট্রপিক লবণগুলি সিলিকা কলামগুলিতে নিউক্লিক অ্যাসিডের বন্ধনকে সহজ করে তোলে। ইথানল (বা কখনও কখনও আইসোপ্রোপানল) এই বন্ধনকে উন্নত করে।সিলিকা কলামগুলিতে রজন থাকে যা লবণের ঘনত্ব এবং অন্যান্য কারণের উপর নির্ভর করে নির্বাচিতভাবে ডিএনএ বা আরএনএকে আবদ্ধ করে. ফলস্বরূপ নিউক্লিক অ্যাসিডগুলি ক্লোনিং, দীর্ঘ-পঠন ক্রম এবং অন্যান্য অ্যাপ্লিকেশনগুলির জন্য উপযুক্ত উচ্চ বিশুদ্ধতা প্রদর্শন করে।

ইথানল ঘনত্ব সমালোচনামূলক প্রমাণিত হয়। অত্যধিক ইথানল বিঘ্নিত উপাদান এবং ছোট অণু precipitates, A260 শোষণযোগ্যতা রিডিং প্রভাবিত।অপর্যাপ্ত ইথানল ঝিল্লি থেকে লবণ অপসারণকে বাধাগ্রস্ত করতে পারে. কিট সরবরাহ করা ইথানল ভলিউমগুলি প্রাক-অপ্টিমাইজ করা হয়, কিন্তু যদি ডিগ্রেডেড ডিএনএ A260 রিডিংগুলিকে বিকৃত করে, ইথানল ঘনত্ব পুনরায় অপ্টিমাইজেশন সাহায্য করতে পারে।হারিয়ে যাওয়া নিউক্লিক এসিড পুনরুদ্ধারের জন্য ঝরনার জন্য প্রবাহিত সমাধান সংরক্ষণ করা যেতে পারেযখন এসডিএস-ধারণকারী ডিটারজেন্টগুলি লিসিসে ব্যবহৃত হয়, তখন NaCl একটি কার্যকর precipitant হিসাবে কাজ করে যা ডিটারজেন্ট দূষণ এড়ায়।

সিলিকা ঝিল্লিগুলির মধ্য দিয়ে লিস্যাটকে সেন্ট্রিফুগ করার পরে, লক্ষ্য নিউক্লিক অ্যাসিডগুলি কলামগুলিতে আবদ্ধ হয় যখন প্রোটিন এবং পলিসাকারাইডগুলি প্রবাহের মধ্যে থাকে। তবে,ঝিল্লিগুলি অবশিষ্ট প্রোটিন এবং লবণ ধরে রাখে. উদ্ভিদ নমুনাগুলি পলিসাকারাইড এবং রঙ্গকগুলি ছেড়ে যেতে পারে; রক্তের নমুনাগুলি প্রায়শই বাদামী বা হলুদ রঙের পরিবর্তন ঘটায়। ধোয়ার পদক্ষেপগুলি এই দূষণকারীগুলি সরিয়ে দেয়।

দুটি ওয়াশ আদর্শ, যদিও সঠিক সংখ্যা নমুনা টাইপ উপর নির্ভর করে। প্রথম ওয়াশ সাধারণত অবশিষ্ট প্রোটিন এবং রঙ্গক অপসারণের জন্য কম chaotrope ঘনত্ব রয়েছে,এর পরে লবণ অপসারণের জন্য ইথানল ওয়াশিংপ্রাথমিকভাবে কম প্রোটিনের নমুনা (যেমন, প্লাজমিড প্রস্তুতি বা পিসিআর পণ্য বিশুদ্ধকরণ) কেবল ইথানল ধোয়ার প্রয়োজন হতে পারে। উচ্চ ফলন এবং বিশুদ্ধতার জন্য সম্পূর্ণ চ্যাট্রোপ অপসারণ অপরিহার্য প্রমাণিত হয়।কিছু কিট ডাবল ইথানল ওয়াশিং সুপারিশ করেঅবশিষ্ট লবণগুলি এলুশনকে বাধা দেয়, ফলন হ্রাস করে এবং A230 রিডিংগুলি বাড়ায় যা A260/230 অনুপাতকে হ্রাস করে।

বেশিরভাগ প্রোটোকলগুলিতে কলম থেকে অবশিষ্ট ইথানল শুকানোর জন্য ওয়াশিং-পরবর্তী সেন্ট্রিফুগেশন অন্তর্ভুক্ত রয়েছে। এই পদক্ষেপটি পরিষ্কার এলুয়েটগুলির জন্য গুরুত্বপূর্ণ প্রমাণিত হয়।10 এমএম ট্রিস বাফার বা জল যোগ করা হয় তারপর ঝিল্লি মুক্তির জন্য নিউক্লিক অ্যাসিড পুনরায় হাইড্রেট করেঅবশিষ্ট ইথানল সম্পূর্ণ রিহাইড্রেশন এবং এলুশন প্রতিরোধ করে।লক্ষণীয় লক্ষণগুলির মধ্যে রয়েছে নমুনাগুলি অ্যাগারোজ জেল কূপগুলিতে বসতে ব্যর্থ হয় (এমনকি লোডিং রঙ্গক উপস্থিত থাকলে) বা -20 °C এ হিমশীতল হতে অক্ষমতা.

ডিএনএ এক্সট্রাকশনের চূড়ান্ত ধাপে সিলিকাস থেকে বিশুদ্ধ নিউক্লিক অ্যাসিড মুক্তি পায়। ডিএনএর জন্য, পিএইচ 8-9 এ 10 এমএম টিরিস স্ট্যান্ডার্ড।ডিএনএ দুর্বল ক্ষারীয় পিএইচ-তে আরও স্থিতিশীল থাকে এবং পানির চেয়ে বাফারে দ্রুত দ্রবীভূত হয়. এমনকি ডিএনএ precipitates অনুরূপ আচরণ। জল সাধারণত নিম্ন পিএইচ প্রদর্শন করে (4-5), এবং উচ্চ আণবিক ওজন ডিএনএ দ্রুত সম্পূর্ণরূপে পুনরায় জলাক্ত করতে পারে না। সর্বোচ্চ ডিএনএ পুনরুদ্ধারের জন্য, এটি একটি অ্যান্টিবায়োটিক ডিএনএ পুনরুদ্ধারের জন্য ব্যবহার করা যেতে পারে।বুফারটি সেন্ট্রিফুগেশনের আগে বেশ কয়েক মিনিট ধরে ঝিল্লিতে বসতে দিন. অক্ষত উচ্চ আণবিক ওজন ডিএনএ প্রয়োজন অ্যাপ্লিকেশন জন্য (যেমন, দীর্ঘ-পঠন ক্রমিকরণ), elution বাফার অপ্টিমাইজ করা হয়। RNA দুর্বলভাবে অ্যাসিডিক পিএইচ সহ্য করে এবং পানিতে সহজে দ্রবীভূত হয়,পানিকে পছন্দের দ্রাবক হিসেবে ব্যবহার করা.

এমনকি স্ট্যান্ডার্ড প্রোটোকল অনুসরণ করে, নিষ্কাশন বিভিন্ন সমস্যার সম্মুখীন হতে পারেঃ

• কম ফলন:প্রায়শই অসম্পূর্ণ লিসিস বা অপ্টিমাল বন্ধন শর্ত থেকে উদ্ভূত হয়। বাফার ক্ষয় এবং বন্ধন ধাপের জন্য সর্বদা তাজা, উচ্চ মানের অ্যানড্রাস ইথানল ব্যবহার করুন।নিম্নমানের বা পুরানো ইথানল আর্দ্রতা শোষণ করতে পারেমনে রাখবেন, ভুলভাবে প্রস্তুত ওয়াশ বাফারগুলি নিষ্কাশিত নিউক্লিক অ্যাসিডগুলিকে ছিনিয়ে নিতে পারে!
• নিম্ন বিশুদ্ধতাঃপ্রোটিন দূষণ প্রায়শই অত্যধিক স্টার্ট উপাদান থেকে উদ্ভূত হয় যা অসম্পূর্ণ দ্রবীভূত হওয়ার ঝুঁকি বাড়ায়। নিম্ন A260/230 অনুপাত সাধারণত অবশিষ্ট লবণ বা অপর্যাপ্ত ওয়াশিং নির্দেশ করে।ওয়াশ বাফারগুলির জন্য সর্বোচ্চ মানের ইথানল ব্যবহার করুন, এবং যদি সমস্যা অব্যাহত থাকে, অতিরিক্ত ধোয়া পদক্ষেপ যোগ করুন।
• দূষণকারীঃপরিবেশগত নমুনাগুলি বিশেষত হিউমিক পদার্থের প্রতি সংবেদনশীল যা ডিএনএর সাথে সহ-পরিষ্কার করে এবং সিলিকা কলাম অপসারণকে প্রতিরোধ করে।বিশেষায়িত কৌশলগুলি কলাম বাঁধার আগে হস্তক্ষেপকারী প্রোটিন এবং হিউমিক্স অপসারণ করতে পারে.
• অবনতিঃআরএনএ এর বিভাজনের ঝুঁকি বেশি, সাধারণত অনুপযুক্ত নমুনা সঞ্চয় বা অকার্যকর লিসিস থেকে (আরএনএজ-মুক্ত জল ব্যবহার করা হয়) ।বিভাজন পিসিআর অ্যাপ্লিকেশনগুলির জন্য কম গুরুত্বপূর্ণ কিন্তু দীর্ঘ-পঠন সিকোয়েন্সিংয়ের জন্য সমালোচনামূলক হয়ে ওঠে যা অক্ষত উচ্চ আণবিক ওজন ডিএনএ প্রয়োজন!
• পিসিআর পণ্য বিশুদ্ধকরণঃডিএনএ নিষ্কাশন কঠোরভাবে না হলেও এটি উল্লেখ করার মতো। সাধারণত, স্পিন কলাম বিশুদ্ধকরণের আগে পিসিআর প্রতিক্রিয়া ভলিউম প্রতি 3-5 ভলিউম লবণ সমাধান যুক্ত করা হয়।ব্যর্থ বিশুদ্ধকরণ সাধারণত ব্যর্থ পিসিআর থেকে আসে, তবে প্রবাহের মাধ্যমে সঞ্চয় করা বুদ্ধিমান যদি স্বচ্ছ পিসিআর ব্যান্ডগুলি কলামগুলিকে আবদ্ধ না করে তবে তারা সম্ভবত পুনরুদ্ধার এবং পুনরায় বিশুদ্ধকরণের জন্য প্রবাহের মাধ্যমে থাকবে।

অসম্পূর্ণ লিসিস অপ্রত্যাশিতভাবে কম ফলন, অসম্পূর্ণ প্রোটিন দ্রবীভূত বা দুর্বল A260/230 অনুপাত হিসাবে প্রকাশ করতে পারে।এর মানে হল যে কিছু নমুনা উপাদানগুলি নিষ্কাশনের সময় সম্পূর্ণরূপে লিজ বা দ্রবীভূত করতে ব্যর্থ হয়েছেঅপূর্ণ লিসিসকে দূষণ বা অবক্ষয় থেকে আলাদা করার জন্য লিসিস বাফারের রচনা, ইনকিউবেশন পরামিতি সহ নিষ্কাশন অবস্থার যত্নবান বিশ্লেষণ প্রয়োজন,এবং সম্ভাব্য হস্তক্ষেপ পদার্থউদাহরণস্বরূপ, দুর্বল A260/230 অনুপাতগুলি অসম্পূর্ণ লিসিসের পরিবর্তে লিঙ্কিংয়ের পরে অবশিষ্ট লবণ বা অপর্যাপ্ত ধোয়ার ইঙ্গিত দিতে পারে।অসম্পূর্ণ লিসিস মোকাবেলা লিসিস বাফার উপাদান অপ্টিমাইজ করার প্রয়োজন হতে পারে, ইনকিউবেশন সময়, অথবা অতিরিক্ত যান্ত্রিক/এনজাইমেটিক লিসিস পদ্ধতি অন্তর্ভুক্ত।

বিশেষায়িত কৌশলগুলি পরিবেশগত নমুনা থেকে হিউমিক পদার্থ এবং অন্যান্য হস্তক্ষেপকারীদের অপসারণকে লক্ষ্য করে যা নিউক্লিক অ্যাসিডের সাথে সহ-পরিষ্কার করতে পারে।এর মধ্যে বিশেষায়িত এক্সট্রাকশন বাফার অন্তর্ভুক্ত রয়েছে যা কেলেটিং এজেন্টগুলি (ই.g., EDTA) নির্বাচনীভাবে ক্যাটিয়ন আবদ্ধ এবং অপসারণ করতে।ডিফারেনশিয়াল সেন্ট্রিফুগেশন বা ফিল্টারিংয়ের মতো প্রাক চিকিত্সা পদ্ধতিগুলি নিউক্লিক অ্যাসিড এক্সট্রাকশনের আগে পরিবেশের নমুনা থেকে বৃহত্তর কণা অপসারণে সহায়তা করতে পারে, বন্ডিং ধাপে হস্তক্ষেপ কমাতে।

কিছু নমুনা (উদাহরণস্বরূপ, টিস্যু বা লিপিড সমৃদ্ধ উপকরণ) নির্দিষ্ট চ্যালেঞ্জ উপস্থাপন করে।সম্পূর্ণ লিসিস এবং নিউক্লিক অ্যাসিড মুক্তি নিশ্চিত করার জন্য টিস্যু নমুনাগুলি প্রায়শই অতিরিক্ত যান্ত্রিক ব্যাঘাত বা এনজাইম্যাটিক হজম প্রয়োজন. লিপিড সমৃদ্ধ নমুনা বিশুদ্ধকরণ জটিল হতে পারে কারণ লিপিডগুলি কলাম ম্যাট্রিক্সে নিউক্লিক অ্যাসিড বন্ডিংয়ের সাথে হস্তক্ষেপ করতে পারে। এই চ্যালেঞ্জগুলি মোকাবেলা করার জন্য লিসিস বাফারের রচনা পরিবর্তন করা প্রয়োজন হতে পারে,বিশুদ্ধকরণ প্রোটোকল অপ্টিমাইজ করা, অথবা বিশেষভাবে ডিজাইন করা কিট ব্যবহার করে।

মূলত ২৮ জুন, ২০১০ তারিখে প্রকাশিত। পর্যালোচনা এবং পুনরায় প্রকাশিত মে ২০২১ এবং মার্চ ২০২৪।